Как приготовить мясо пептонный бульон

Бульон мясо-пептонный — жидкая питательная среда для культивирования микробов, состоящая из мясной воды и пептона.

Мясную воду изготовляют из говяжьего или конского мяса. На 1 л воды берут 500 г мясного фарша, выдерживают 18—24 часа при t° 4— 6° и кипятят в течение часа. Всплывающие на поверхность капельки жира снимают, доливают водой до первоначального объема и фильтруют через фильтровальную бумагу или фильтровальное полотно до получения прозрачной жидкости желтоватого цвета — мясной воды. Оставшийся на фильтре осадок используют для получения триптического перевара. Полученную мясную воду используют для приготовления Бульона мясо-пептонного. С целью длительного хранения к мясной воде добавляют 1—1,5% хлороформа, тщательно взбалтывают и хранят в прохладном месте в герметически закрытых бутылях. При хранении без консерванта мясную воду стерилизуют 30 мин. при t° 120°.

К мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% хлорида натрия, кипятят при помешивании до растворения пептона, затем доводят pH до слабощелочной реакции, после чего вновь кипятят 10 мин., снова проверяют реакцию и отфильтровывают от осадка через фильтровальную ткань. Для получения более прозрачной среды перед фильтрованием Бульона мясо-пептонного можно осветлить, для чего на 1 л бульона, охлажденного до t° 50°, добавляют тщательно разболтанный в двух объемах холодной воды белок одного куриного яйца или 20—30 мл нормальной лошадиной сыворотки, или 10—20 г сырого мясного фарша. Иногда от прибавления белка питательная среда становится еще более мутной, поэтому рекомендуется предварительная проба просветления бульона в пробирке: к 10 мл среды добавляют 0,3 мл взболтанного белка или сыворотки. После прибавления белка Б. м.-п. хорошо размешивают и кипятят на огне в течение 10 мин. или нагревают в автоклаве при t° 105° в течение 30 мин. Затем среду фильтруют.

Бульон мясо-пептонный содержит ок. 0,24% общего азота, 0,07% аминного азота, 3% сухого остатка, 1,3% окисляемых веществ, 1,5% золы и 0,8% хлоридов. В качестве жидкой питательной среды Бульон мясо-пептонный применяется для культивирования различных микроорганизмов, а также как жидкая основа для изготовления сложных питательных сред.

Библиография: Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О. Биргера, с. 49, М., 19,73.

Первый этап- получение мясной воды. Мясо, очищенное от жира и от сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают двойным количеством холодной водопроводной воды и настаивают в течение суток в прохладном месте. Затем мясной настой вместе с мясом кипятят в течение 1 часа, после чего остужают, фильтруют, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по бутылям и стерилизуют при давлении 1атм. 30 минут.

Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины.

Второй этап- к мясной воде прибавляют 1% сухого пептона и 0,5% хлорида натрия, кипятят, устанавливают рH 20 % раствором едкого натра.

Приготовление мясо — пептонного агара (МПА)

К мясо — пептоному бульону добавляют 2% морской водоросли агар-агара, который плавится при 100°С и затвердевает при комнатной температуре. После стерилизации в автоклаве мясо — пептонный агар, разлитый в пробирки, оставляют застыть столбиком или готовят скошенный агар, укладывая пробирки в наклонном положении под углом 20°С.

Питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

1. питательность - среды должны содержать доступные источники азота, углерода и энергии;

2. изотоничность - они должны содержать набор солей для поддержания осмотического давления;

3. оптимальный показатель рН (для большинства бактерий 7,2-7,6);

4. оптимальный окислительно-восстановительный (редокс) потенциал - высокий для аэробов, низкий для анаэробов;

5. прозрачность, чтобы был виден рост бактерий;

6. стерильность, чтобы не было других бактерий.

28.Классификация сред.

По происхождению среды подразделяют на естественные (природные), искусственные и синтетические.

-Естественные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, желчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

-Искусственные среды изготовлены по определённым рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

-Синтетические среды – содержат определённые химические соединения в точно указанных концентрациях.

По концентрации среды бывают жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие, сухие.

По назначению среды подразделяют на основные (простые: 1%-ная пептонная вода, мясопептонный бульон/агар, бульон/агар Хоттингера и сложные: сахарный бульон/агар, сывороточный бульон/агар, кровяной агар, желчный бульон, желточно-солевой агар); специальные (обогащенные, среды для хранения), элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие, транспортные, накопительные.

-основные (МПА, МПБ) – простые по составу и применяются для культивирования большинства неприхотливых бактерий;

-обогащенные – на основе простых + кровь, сыворотка, асцитическая жидкость и др. Используют для накопления определенной группы бактерий за счет создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества – соли желчных кислот, тетратионат Na⁺, теллурит K⁺; антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зеленый и др.

-дифференциально-диагностические - позволяют различить бактерии по их росту, биохимической активности и другим признакам. В состав этих сред, кроме питательных веществ, обычно включают субстрат, по отношению к которому дифференцируются бактерии, и индикатор. Если микроб ферментирует субстрат, входящий в состав среды, то сдвигается рН среды, и в результате колонии окрашиваются в цвет индикатора;

-элективные - используют для избирательного культивирования микроорганизмов определенных видов при подавлении роста других микроорганизмов за счет добавления в среду различных ингибиторов роста микробов, изменения показателя рН, состава питательных веществ в среде и др.

-среды накопления - на которых одни виды размножаются быстрее других;

-транспортные и консервирующие среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов, их применяют для временного сохранения микроорганизмов после взятия исследуемого материала.

29.1) лаг-фаза (англ. lag — запаздывание) — период между посевом бактерий и началом их размножения, продолжительностью 4-5 часов;

Z) фаза логарифмического (экспоненциального) роста — период интенсивного деления бактерий, продолжительностью 5-6 часов;

3) фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток не изменяется, составляя максимальный уровень (М-концентрация);

4) фаза гибели бактерий.

30. Для получения изолированных колоний на практике наиболее часто используют модифицированный метод по Дригальскому (или метод «механического» разобщения). Для этого материал наносят частыми штрихами на поверхность плотной питательной среды в верхней трети чашки. Затем, отступив от основного посева, продолжают посев параллельными частыми штрихами на оставшейся поверхности среды. Подобный метод позволяет получить изолированные колонии и изучать их.

Указанные методы пригодны для посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.

-Биологический метод получения чистых культур бактерий. Исследуемым материалом заражают лабораторное животное, чувствительное к какому-то одному микроорганизму, содержащемуся в патологическом материале. У животного возникает инфекционный процесс с накоплением возбудителя во внутренних органах, из которых и выделяют чистую культуру.

-Культуральный метод получения чистых культур бактерий. Используется только для бактерий рода Proteus, обладающих «ползучим» характером роста из-за наличия большого количества жгутиков. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду у основания скошенного МПА. Протей «выползает» на скошенную часть среды, в то время как остальные бактерии растут на месте посева.

-Физический метод получения чистых культур бактерий. Используется для получения чистых культур спорообразующих бактерий. Исследуемый патологический материал подвергают кипячению в течение 5 минут для уничтожения не образующих спор ассоциантов, после чего засевают материал на питательные среды.

-Химический метод получения чистых культур бактерий. Используется для получения чистых культур кислотоустойчивых микроорганизмов, главным образом, микобактерий. Исследуемый патологический материал обрабатывают 5%-м раствором серной кислоты, под действием которого погибают некислотоустойчивые ассоцианты. После нейтрализации кислоты материал засевают на питательные среды

-Метод механического разобщения для получения чистых культур бактерий.

а) Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й – минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма.

б) Рассев петлей (посев штрихами). Метод принципиально не отличается от предыдущего, но более экономичен. Берут одну (. ) чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки.

31. Анаэробы. Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах — анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэробные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера, Цейсслера и Вёйнберга.

Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислорода) — рост анаэробов.

Метод Цейсслера используют для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого проводят посев на среду Китта-Тароцци, прогревают 15 мин при 80°С (для уничтожения вегетативных форм), заливают вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч. Затем проводят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования подозрительные колонии изучают и отсевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Вёйнберга используют для получения чистых культур строгих анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, вносят в сахарный бульон. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным МПА, погружая пастерку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, что позволяет зафиксировать отдельные бактериальные клетки в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют, и изучают выросшие колонии. При обнаружении подозрительной колонии на её месте делают распил, колонию быстро отбирают и засевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

32. На первом этапе для получения изолированных колоний делают посев исследуемого материала, как правило, на плотные питательные среды, выбор к-рых обусловливается свойствами предполагаемого возбудителя. Применяют по возможности элективные среды, на к-рых растет только данный вид бактерий, или дифференциально-диагностические среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов.

На втором этапе проводят исследование колоний бактерий, происходящих от одной бактериальной клетки и выросших на плотной питательной среде (колония и является чистой культурой возбудителя).

Третий этап заключается в идентификации выделенной чистой культуры возбудителя и определении его чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам. Идентификацию выделенной бактериальной культуры осуществляют по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным, токсигенным свойствам.

33. Культуральные свойства бактерий - питательные потребности, условия роста и характер роста бактерий на бактериол. средах. В питательные потребности включают источники углерода, азота и ростовых факторов, способность бактерий расти на определенных питательных средах, в условия роста - рН, Eh, концентрацию О2 плотность, осмотическое давление среды, температуру роста; в характер роста - скорость роста (быстрый, медленный), внешний вид к-ры на жидких, плотных и полужидких средах, изменения, к-рые наступают в среде или отдельных ее компонентах в процессе роста микробов. Сведения о К.с. используют при выборе способов культивирования и при идентификации выделенной к-ры.

Для культивирования микробов в лабораторных усло­виях готовят питательные среды с учетом потребности в питательных веществах каждого вида в отдельности. Питательная среда в своем составе должна содержать углерод, водород, кислород, азот, фосфор, серу, магний, железо, микроэлементы и биостимуляторы роста.

Различают питательные среды естественные(молоко, яйца, картофель и т. п.),искусственные,приготовленные из продуктов животного или раститель­ного происхождения, исинтетические(среды Чапека, Сабуро). По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными.

Для приготовления плотных сред в жидкие среды добавляют агар-агар или желатин. Агар-агар представляет собой продукт переработки высушенных морских водорослей рода анфельция, состоящий в основном из полисахаридов. В холодной воде агар-агар набухает и размягчается, в горячей (90—100° С) расплавляется, образуя клееобразную массу. Застывает агар-агар при 40° С, образуя студень. Как питательное вещество агар-агар микробами не используется.

Желатин получают путем вываривания кожи, костей и сухожилий животных. При нагревании с водой желатин образует коллоидный раствор, застывающий при 18—20° С в однородный коллоидный студень и рас­плавляющийся при 25—27° С.

В бактериологической практике обычно применяют среды из продуктов животного и растительного происхождения, содержащие пептоны, экстрактивные вещества мяса, кровь, сыворотку, сусло, углеводы и т. п.

Необходимые питательные вещества должны содержаться в среде в доступной форме и в определенных соотношениях.

Питательные среды должны быть стерильными (должно быть обеспечено получение чистых культур микроорганизмов), прозрачными (выросшие на них мик­роорганизмы должны быть хорошо видны и иметь опре­деленную величину рН).

Хранят готовые среды в прохладном месте, в плотно закрывающихся шкафах или ящиках, что предохраняет их от быстрого высыхания. Надолго хранившихся средах микробы развиваются слабо или совсем не растут.

Питательные среды принято делить на три группы:

1) стандартные (универсальные) — предназначаются для культивирования большинства микробов;

2) специальные элективные, избирательные — предназначаются для выращивания только определен­ного вида микробов, рост других микроорганизмов на этих средах подавляется;

3) дифференциально-диагностические — предназначаются для изучения биохимических свойств микробов с целью дифференцирования различных видов микроорганизмов.

Стандартные питательные среды

Мясопептонный бульон (МПБ).В состав МПБ входят мясная вода, пептон и поваренная соль. Для приготовления мясной воды используют свежее мясо крупного рогатого скота или лошадей. Мясо освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водой из расчета 1:2 (например, 1 кг фарша заливают 2 л воды). Ставят на 18—20 ч в прохладное место (4—6° С), затем кипятят в течение часа и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема, разливают его по колбам или бутылям и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. Или заливают двукратным количеством воды, кипятят в тече­ние часа, дают остыть, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема и стерилизуют его в течение 30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.

При варке мясной воды на поверхности жидкости появляется некоторое количество жира, который необхо­димо снять.

Для приготовления МПБ к мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% химически чистой поваренной соли, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,2—7,4 прибавлением щелочи или двууглекислой соды и снова кипятят 10 мин. Профильтрованный бульон должен быть цвета соломы и совершенно прозрачным. Бульон разливают по пробиркам и колбам, закрывают ватными пробками, пробки обвязывают пергаментной бумагой и стерилизуют 20—30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.

Мясопептонный агар (МПА). К мясопептонному бульону добавляют 2—3% нарезанного агар-агар; нагревают в автоклаве или в текучепаровом аппарате до полного расплавления агар-агара. Устанавливают рН 7,2—7,4. Дают остыть до 50° С, осветляют путем добавления белка одного куриного яйца, разведенного двойным количеством дистиллированной воды . Ставят на 20 мин в автоклав при избыточном давлении 0,1 МПа для свертывания белка и тем самым осветляют среду, фильтруют через слой марли и ваты (рис. 1). Можно пользоваться другой методикой. К мясопептонному бульону добавляют 2—3% нарезанного агар-агара, нагревают до полного расплавления его. После остывания застывший плотный агар вынимают из посу­ды и отрезают нижнюю часть, содержащую осадок. За­тем вновь расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Необходимо, чтобы прозрачность агара позволяла свободно читать напечатанный на бумаге шрифт при наложении на него бактериологической чашки с агаром, налитым слоем толщиной 20 мм. После стерилизации для того, чтобы агар в пробирках застыл столбиком, их оставляют в вертикальном положении. Если нужно при­готовить агар скошенной формы, пробирки с расплавлен­ным агаром располагают в наклонном положении так, чтобы среда заняла две трети пробирки, и в таком виде оставляют до застывания среды (рис. 2). При этом про­бирки необходимо предохранять от действия солнечного света.

Мясопептонный желатин (МПЖ).К мясопептонному бульону добавляют 10% зимой и не менее 18—20% летом измельченного желатина и подогревают в текучепаровом аппарате до полного растворения желатина. Подщелачивают среду до рН 7,2 путем добавления 10%-ного раствораNaОН. После охлаждения до 60° С осветляют яичным белком (в таком же количестве, как и для МПА), подогревают в текучепаровом аппарате 20—30 мин. В горячем виде фильтруют через ватный или марлевый фильтр и разливают по пробиркам. Стери­лизуют дробно по 15—20 мин три дня подряд при температуре 100° С.

Картофельная среда.Отбирают крупный картофель, промывают щеткой под водопроводной водой, удаляют кожуру и поврежденные места. Клубни снова моют под струей водопроводной воды и помещают в 1%-ный раствор двууглекислой соды на 2—3 ч для ней­трализации кислой среды. Из картофеля пробником вырезают столбики, диаметр которых должен соответство­вать ширине пробирок. Столбики помещают в чашки с водой и разрезают по диагонали на две части, подсуши­вают фильтровальной бумагой и половинки помещают в пробирки с перехватом внизу (в нижнюю часть этих пробирок стекает вода, выделяемая при стерилизации). За неимением специальных пробирок используют обыч­ные пробирки, поместив на дно стеклянные или деревян­ные палочки, а на них — картофель. Стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20—25 мин.

Пептонная вода. Приготовляют ее различными способами. В 1 л дистиллированной воды растворяют 5 г химически чистой поваренной соли и 10 г пептона и сте­рилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 10 мин. Для выращивания гнилостных бактерий пептонную воду готовят несколько иначе: в 1 л ди­стиллированной воды растворяют 30 г пептона. Стерили­зуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Концентрированная глюкозопептонная среда. В 1 л воды растворяют 100 г пептона и 50 г поваренной соли, нагревают до кипения, отфильтровывают, добавляют 50 г глюкозы, устанавливают рН 7,4— 7,6 (с помощью насыщенного раствора углекислой соды), разливают по 10 мл в колбы и склянки емкостью 250 мл с поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром. Разведенная глюкозопептонная среда. В 1 л воды растворяют 10 г пептона и 5 г поваренной соли, нагревают до кипения и добавляют 5 г глюкозы. Устанавливают рН среды 7,4—7,6, разливают по 10 мл в пробирки с поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром.

Сухой питательный агар. Содержит рыбный или мясной бульон, агар, хлористый и фосфорнокислый натрий. К 5 г порошка агара добавляют 100 мл холод­ной дистиллированной воды. Тщательно взбалтывают и нагревают при помешивании до полного растворения агара, не допуская пригорания. По мере надобности раствор фильтруют, разливают по пробиркам, стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин.

Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который получают следующим образом: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилий заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50—55°С. Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй — через бумажный фильтр). Фильтрат доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они служат фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации.

Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация мясного бульона не требуется.

Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, затем мясо отжимают. При этом бульон получается хорошего качества. При потребности в мясном бульоне особо высокой питательности во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин способствует дополнительной гидролизации белковых соединений мяса, и в результате количество доступных бактериям питательных веществ возрастает. Мясо можно заменить мясным экстрактом (5 г на 1 л среды).

Для приготовления МПБ к 1 л мясного бульона добавляют 5—10 г пептона (первый продукт гидролиза белка) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли для создания осмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая.

Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na₂CO₃ до посинения влажной красной лакмусовой бумажки. Дли проверки рН среды удобно использовать индикатор бромтимолблау: 1—2 капли его смешивают в фарфоровой чашке с каплей бульона. В нейтральной среде бромтимолблау — бутылочно-зеленый, в кислой — желтый, в щелочной — синий.

После установления рН среду снова кипятят 5—10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Для этого свежий яичный белок взбивают с двойным по объему количеством воды и смешивают с охлажденным до 50 °С бульоном. Смесь кипятят, помешивая, на слабом огне 10 мин, затем фильтруют. Прозрачный мясо-пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л МПБ добавляют 15— 20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления — 100 °С, затвердевания — 40 °С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na₂CO₃ и через воронку разливают в пробирки (приблизительно по 10 мл агара столбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара — косяков).

При разливе агара необходимо следить за тем, чтобы края пробирок оставались сухими, иначе пробки прилипнут к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ).В 1 л МПБ помешают 100—150 г желатины. Температура плавления желатины зависит от ее содержания в среде: в случае 10%-ной концентрации в среде она плавится при 24 °С; в случае 15%-ной — при 25 °С. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины.

После растворения желатины при осторожном нагревании устанавливают слабощелочную реакцию среды (как для МПБ и МПА), кипятят 5 мин, затем охлаждают до 40—50 °С. Взбитый, с небольшим количеством воды яичный белок вливают в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков в осадок становится прозрачной. Ее фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду 3 раза по 30 мин каждые 24 ч.

Картофельный агар. Нарезают ломтиками 200 г очищенного и промытого водой картофеля, заливают 1 л водопроводной воды, варят 30 мин. Отвар фильтруют через вату и добавляют воду до первоначального объема. К полученной жидкости прибавляют 2% агара, кипятят до его расплавления и устанавливают нейтральную реакцию среды (рН = 7). Среду стерилизуют 20 мин при 1 атм 1 .

Пивное сусло и сусло-агар. Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при 35 °С. После того как ростки станут вдвое длиннее зерен, последние высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогревании), получая солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и смешивают с водой (250 г солода на 1 л воды). Для лучшего выделения фермента амилазы смесь подогревают при 57 °С до исчезновения реакции на крахмал (синего окрашивания с иодом). Пробы на осахаривание крахмала проводят в фарфоровой чашке в капле жидкости.

Сусло процеживают через вату, затем фильтруют через бумажный фильтр. Такое сусло содержит 10—20% сахара. Точное его содержание определяют по плотности раствора при помощи сахариметра. Сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6—8% и стерилизуют 30 мин при 115 °С и давлении 0,5 атм. Готовое сусло можно получить на пивоваренном заводе.

Для приготовления сусло-агара к пивному суслу добавляют 2,5—3% агара, кипятят до расплавления, фильтруют через вату и стерилизуют при тех же условиях, как и пивное сусло.

Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных сред используют снятое молоко, так называемый обрат, так как жир в молоке неблагоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов. Обрат получают сепарированием молока, нагретого до 34 °С. Можно удалять жир и при отстаивании молока.

При стерилизации следует помнить о том, что молоко нельзя длительное время выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в молоке, может карамелизоваться.

Обезжиренное молоко разливают в стерильные пробирки и выдерживают при 115 °С (давление 0,5 атм) 10 мин. Перед стерилизацией кислотность обрата не должна превышать 22° Тернера, иначе молоко свернется. После стерилизации его выдерживают 3 сут в термостате при 30°С. чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и других стойких к нагреванию форм. Через 3 сут пробирки с молоком просматривают и те, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают.

При стерилизации в автоклаве иногда возможно побурение молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизании казеина. При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина, который может частично пептонизироваться. Перегретoe побуревшее молоко в качестве среды использовать нельзя.

Дрожжевые среды. Дрожжевая вода. 50—100 г сухих дрожжей разводят в 1 л воды, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение 3 дней ежедневно.

Дрожжевой автолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л воды; добавляют 2 г Na₂HPO₄, каплями I н. раствор NaOH (до рH 6,1) и 5 мл хлороформа, выдерживают при 37 °С 2 сут, доводят раствором NaOH до рН 7,4, кипятят 30 мин. фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют при 115 °С 30 мин.

Дрожжевой экстракт. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115 °С 30 мин.

Бобовый отвар. 50 г фасоли (лучше белой) заливают 1 л водопроводной воды и варят до готовности так, чтобы бобы не разварились. Полученный отвар фильтруют через вату, добавляют к нему 10 г сахара и доводят до первоначального объема. Устанавливают слабощелочную реакцию среды, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве 30 мин при давлении пара 1,5 атм.

1 По системе СИ давление принято выражать в паскалях (Па): 1 атм = 1,01325 х 10 5 Па = 0,1 МПа.

Дата добавления: 2014-01-04 ; Просмотров: 4785 ; Нарушение авторских прав?

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Для культивирования микроорганизмов используют различные питательные среды. Это необходимо для дифференциации инфекцион­ных болезней, для приготовления вакцин, антибиотиков и др.

К питательным средам предъявляют следующие требования: должны содержать все необходимые вещества для питания микробов, иметь определенную реакцию среды, быть стерильными и обязательно влажными. Питательные среды подразделяют на Простые и сложные.

К простым средам относятся мясопептонный бульон, мясо­пептонный агар, мясопептонный желатин (МПЖ). Все простые питатель­ные среды готовят на мясной воде. Для ее приготовления мясо отде­ляют от жира и фасций, измельчают, заливают водой в соотношении 1:2 и кипятят в течение 30-60 мин. Затем фильтруют, доливают до перво­начального объема и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 30 мин.

Приготовление МПБ состоит в следующем. К 1 л мясной воды добавляют 1 % Пептона, 0,5 % Поваренной соли. Устанавливают реак­цию среды (рН 7,2-7,4), кипятят, фильтруют, разливают по колбам и стерилизуют при давлении 0,1 МПа 15-20 мин.

По консистенции питательные среды могут быть Жидкими, полу­жидкими и плотными. Для приготовления полужидких и плотных сред к МПБ добавляют агар (соответственно 0,2-0,3 и 2-3 %). Агар - это вещество, получаемое из морских водорослей. В его состав входят пектиновые вещества. Агар плавится при 90-100 °С и застывает при температуре ниже 45 "С. Как питательное вещество агар микроорга­низмами не используется.

При приготовлении МПА к мясопептонному бульону добавляю 2-3 % Агара, а при приготовлении МПЖ - к мясопептонному бульону добавляют пищевой желатин: 10-12 % - зимой, 18-20 % - летом.

Сложные (специальные) питательные среды готовят для культивирования микробов, которые не растут на обычных, простых средах. Например, яичную среду Петраньяни используют для выращивания туберкулезной палочки. В состав среды входят молоко, картофельная мука, пептон, яичный белок, 2 %-ный водный раствор малахитовой зелени.

К сложным питательным средам относятся дифференциально-диаг­ностические среды (Эндо, Плоскирева и др.), которые служат для отличия одних групп или видов микробов от других. Например, среда Эндо состоит из МПА, лактозы, фуксина основного, обесцвеченного щелочью. На этой среде кишечная палочка растет в виде темно-крас­ных колоний с металлическим блеском, так как сбраживает лактозу с образованием молочной кислоты, которая восстанавливает обесцве­ченный фуксин. Сальмонеллы на среде Эндо растут в виде бесцветных колоний. Они не ферментируют лактозу.

Для выращивания анаэробов готовят среду Китта-Тароцци (МППВ), состоящую из печеночного бульона, кусочков печени на дне пробирки и вазелинового масла, налитого сверху.

Для изучения способности микробов сбраживать сахара в лабора­ториях используют полужидкие углеводные среды, состоящие из пептонной поды, 0,2-0,3 % Агара, моноуглевода и индикатора.

Протеолитнческие свойства микробов (способность расщеплять белки) изучают на желатине, свернутой кровяной сыворотке и молоке.

Среды накопления используют для подавления одних видов микробов и создания благоприятных условий для развития других. Наиболее часто в лабораториях используют накопительные среды (Кауфмана, Мюллера, селенитовую, хлористомагниевую М), которые задерживают рост гнилостных микробов и не препятствуют размноже­нии) сальмонелл.

Для культивирования микробов применяют также синтети­ческие среды, которые включают определенные химические вещества, необходимые для питания микроорганизмов.

Заводы выпускают некоторые питательные среды (МПА, среда Эндо и др.) в высушенном виде, что значительно облегчает метод их приготовления в лабораториях.

Мясопептонного бульон (МПБ) — жидкое питательную среду для культвування микроорганизмов, состоящее из воды и пептона (1-2%); служит основой многих других питательных сред.

Приготовление

Для приготовления мясо-пептон сред используют мясной бульон, который получают так: 500 г мелко порубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилия заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50 ° С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50-55 ° С Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят в течение 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй — через бумажный фильтр). Фильтр доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрываю! ватными пробками и стерилизуют при 120 ° С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бума ги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они являются фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации. Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предыдущая стерилизация лишняя. Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, а затем мясо отжимают. Бульон получается хорошего качества. Если желательно иметь мясной бульон особо высокой питательности, во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин дополнительно гидролизуют белковые соединения мяса, и количество усваиваемых бактериями питательных веществ растет. Мясо можно заменить мясным экстрактом, беря его по 5 г на 1 л среды. Для приготовления мясопептонного бульона до 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (пептон — первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли с целью создания осмотического активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, прилива 20% -ный раствор NagCOa (до посинения влажной красной лакмусовой бумажки, при этом фенолфталеин еще не показывает щелочную реакцию — при добавлении его к среде в фарфоровой чашке розовая окраска не проявляется). Удобно использовать индикатор бромтимолблау. 1-2 капли его вносят стеклянной палочкой в ​​фарфоровую чашку и добавляют каплю бульона. В нейтральной среде бромтимолблау бутылочное-зеленый, в кислой — желтый, в щелочной — синий. После установления реакции среду снова кипятят 5-10 мин и белки, свернулся от изменения реакции отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлить его белком. Прозрачный Мясо-пептоны бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 ° С в течение 20 мин.

Мясная вода. Свежее мясо крупного рогатого скота освобождают от костей, жира и сухожилий и

пропускают через мясорубку. 500 г фарша заливают 1 л водопроводной воды и выдерживают в

течение 15 - 18 часов в прохладном месте. Затем настой кипятят в течение 30 - 40 минут, доливают

дистиллированной водой до первоначального объема и фильтруют через ватно-марлевый фильтр

или через полотно. Полученную мясную воду стерилизуют при 120° в течение 20 мин.

Печеночная вода. Свежую печень крупного рогатого скота освобождают от жира, канальцев,

пленок и пропускают через мясорубку. 500 г фарша заливают 1 л водопроводной воды, настаивают в

течение 1 часа и кипятят при помешивании в течение 3 минут. После отстаивания фарш удаляют, а

жидкость доливают дистиллированной водой до первоначального объема и фильтруют через ватно-

марлевый фильтр. Разливают по колбам, стерилизуют при 112° (0,5 атм.) в течение 30 - 40 минут.

Мясо-пептонный печеночно-глюкозно-глицериновый агар (МППГГА). К 610 мл мясной воды

добавляют 305 мл печеночной воды, 10 г пептона, 5 г х.ч. хлорида натрия и 20 - 30 г агар-агара,

предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь варят в течение 1 часа в автоклаве, фильтруют

через нейлоновый или ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,2, добавляют 10 г глюкозы и 20

мл глицерина. Среду разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при 110° (0,4 атм.) в течение

30 минут. рН среды до стерилизации - 7,3 - 7,4, после стерилизации - 6,8 - 7,0.

Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) готовят аналогично МППГГА, но без добавления

агар-агара, глюкозы и глицерина.

Печеночно-глюкозно-глицериновый агар (ПГГА). К печеночной воде добавляют 1% пептона,

0,5% х.ч. хлорида натрия и 2 - 3% агар-агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь

варят в течение 1 часа в автоклаве, фильтруют через нейлоновый или ватный фильтр, устанавливают

рН 7,0 - 7,2, добавляют 1% глюкозы и 2 - 3% глицерина. Среду разливают в пробирки или колбы и

стерилизуют при 110° (0,4 атм.) в течение 30 минут.

Печеночно-глюкозно-глицериновый бульон готовят аналогично ПГГА, но без добавления агар-

Картофельный агар. 500 г очищенного картофеля (берут белые или желтые клубни средней

величины), нарезанного ломтиками, варят в 1 л водопроводной воды до готовности (избегать

сильного разваривания картофеля). Затем отвар фильтруют через ватный фильтр и дистиллированной

водой доводят объем до первоначального (1 л). К фильтрату добавляют 1% пептона, 0,5% х.ч.

хлорида натрия и 2 - 3% агар-агара. Смесь варят до полного расплавления агара, устанавливают рН

7,2 и отстаивают в теплом месте. В застывшем агаре срезают нижний слой с осадком, а прозрачную

часть агара расплавляют и фильтруют через ватный фильтр. Вновь устанавливают рН 7,2, добавляют

1% глюкозы, и 3% глицерина, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют при 115° (0,7 атм.)

в течение 20 - 30 минут. После стерилизации рН среды 6,8.

Сывороточно-декстрозный агар. К 835 мл дистиллированной воды добавляют 20 г агар-агара,

10 г пептона, 5 г х.ч. хлорида натрия и 165 мл мясной воды. Смешивают, кипятят до расплавления

агара, устанавливают рН 7,8. Затем стерилизуют текучим паром в течение 1 часа, после чего пар

закрывают, давление доводят до 2 атм. и нагреватель выключают. После автоклавирования среду

отстаивают в течение 1 часа, затем фильтруют через ватный или бумажный фильтр, доводят рН до

7,4, разливают в колбы, учитывая объем среды, и стерилизуют при 115° (0,7 атм.) в течение 15 минут.

Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 50° и добавляют к ней нормальную

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

сыворотку крови крупного рогатого скота или лошади и раствор декстрозы, профильтрованные через

фильтр Зейтца. Конечная концентрация сыворотки в среде должна быть 10%, декстрозы - 1%.

Плотный печеночно-сывороточный и печеночно-аминопептидный агар. К 1000 мл печеночной

воды добавляют 10 г пептона, 5 г х.ч. хлорида натрия, 20 г агар-агара. К полученной смеси добавляют

17 мл 10-процентного раствора двууглекислой соды и автоклавируют при 115° (0,7 атм.) в течение 20

- 25 минут, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,0 - 7,2 и добавляют 10 г глюкозы и

20 мл глицерина. Разливают в колбы и стерилизуют при 110° (0,4 атм.) в течение 20 минут. Хранят в

прохладных условиях. Перед употреблением смесь расплавляют, охлаждают до 50° и добавляют 10 -

20% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота (овец) или 10 - 15% аминопептида, затем

разливают в пробирки или бактериологические чашки.

Полужидкий печеночно-сывороточный и печеночно-аминопептидный агар. Берут мясной

печеночной воды по 500 мл, добавляют 10 г пептона, 5 г х.ч. хлорида натрия, 1,5 - 2 г агар-агара.

Устанавливают рН 7,0 - 7,2. Смесь кипятят, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при 115°

(0,7 атм.) в течение 30 минут. Хранят на холоде. Перед употреблением добавляют стерильную

сыворотку крови крупного рогатого скота или овец или аминопептид из расчета 10% к объему среды

и разливают в пробирки.

Эритрит агар. Представляет собой готовую питательную среду для выделения бруцелл.

Первый этап- получение мясной воды. Мясо, очищенное от жира и от сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают двойным количеством холодной водопроводной воды и настаивают в течение суток в прохладном месте. Затем мясной настой вместе с мясом кипятят в течение 1 часа, после чего остужают, фильтруют, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по бутылям и стерилизуют при давлении 1атм. 30 минут.

Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины.

Второй этап- к мясной воде прибавляют 1% сухого пептона и 0,5% хлорида натрия, кипятят, устанавливают рH 20 % раствором едкого натра.

Смотреть что такое "мясопептонный бульон" в других словарях:

мясопептонный бульон — (МПБ) жидкая питательная среда для культивирования микроорганизмов, состоящая из мясной воды и пептона (1 2%); служит основой многих других жидких питательных сред … Большой медицинский словарь

бульон питательный — мясной отвар, питательная среда, применяемая для культивирования микроорганизмов, участвующих в деградации белков. В зависимости от добавок различают, напр., глицериновый Б., нитратный Б., лактозный Б., наибольшее распространение имеет… … Словарь микробиологии

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ — ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, искусственные среды того или иного состава, предназначенные для культивирования микробов и простейших в лабораторных условиях. Впервые были введены для изолирования отдельных видов бактерий Р. Кохом в 1881 году, что создало… … Большая медицинская энциклопедия

Пита́тельные сре́ды — субстраты, состоящие из компонентов, обеспечивающих необходимые условия для культивирования микроорганизмов или накопления продуктов их жизнедеятельности. Питательные среды различаются по назначению, консистенции и составу. По назначению их… … Медицинская энциклопедия

Питательная среда — Питательная среда вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро и микроорганизмов. Существует множество стандартных биологических питательных сред. Содержание 1 Требования, предъявляемые к средам 2 Классификация … Википедия

Бактерии — под именем бактерий в науке известны мельчайшие, микроскопической величины организмы, принадлежащие к растительному царству. По своей организации, по своим морфологическим особенностям, Б. ближе всего стоят к так называемым циановым или… … Энциклопедический словарь Ф.А. Брокгауза и И.А. Ефрона

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ — Аг антиген АЕ антитоксическая или антигенная единица антибактер. антибактериальный Ат антитело АТФ аденозинтрифосфорная кислота бактер. бактериальный бактериол бактериологический бактериоскоп. бактериоскопический БАС бактерицидная активность… … Словарь микробиологии

Брюшной тиф — Не следует путать с сыпным тифом. Брюшной тиф … Википедия

Абдоминальный тиф — Брюшной тиф Файл:Salmonella typhi.jpg МКБ 10 A01.0 МКБ 9 002 Тиф брюшной острая антропонозная бактериа … Википедия

Вейнберга среда — (М. В. Вейнберг, 1868 1940, микробиолог) 1) полужидкая питательная среда, применяемая для культивирования патогенных анаэробов, представляющая собой мясопептонный бульон, содержащий 1% агара и 0,2% глюкозы; 2) (син. среда обогащения Vf) жидкая… … Большой медицинский словарь

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 4

Тема: Бактериологический метод диагностики заболеваний человека. Питательные среды, методы выделения чистых культур. Первый этап выделения чистой культуры.

Цель: Познакомиться с многообразием питательных сред для выделения возбудителей заболеваний человека, отработать методику посева микроорганизмов на жидкие и плотные питательные среды, усвоить принцип выделения чистой культуры аэробов.

1. Основные понятия о систематике микроорганизмов, термины, применяемые для обозначения систематических единиц.

2. Типы питательных сред. Основные требования к питательным средам.

3. Способы приготовления, стерилизации и использования питательных сред.

1. Способы культивирования микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах Классификация бактерий по источнику энергии.
2. Как делят бактерии по источнику углерода
3. Как подразделяют бактерии по источнику азота
4. Какие бактерии называют гетеротрофами
5. Какие бактерии относятся к автотрофам
6. Какие бактерии называют ауксотрофами

1. Приготовить питательную среду по прописи, простерилизоватье ее и разлить по пробиркам или чашкам Петри.

2. Делать посевы петлей разными методами на плотные и жидкие среды.

3. Делать посевы по методу Коха, Шукевича, Дригальского

1. Чем сопровождается рост бактерий?

2. Транспорт питательных веществ у бактерий.

3. Отличительные признаки процессов питания у бактерий.

4. Поступление питательных веществ в клетку без затраты энергии.

5. Поступление питательных веществ в клетку с затратой энергии.

6. Как культивируют большинство бактерий?

7. Какие существуют требования для питательных сред

8. Естественные питательные среды.

9. Плотные питательные среды.

10. Дифференциально-диагностические среды.

11. Элективные среды.

12. Универсальные среды.

13. Способы получения чистых культур.

14. На какой среде выделяют чистую культуру аэробов?

15. Что проводят на первом этапе выделения чистой культуры аэробов?

16. Второй этап выделения чистой культуры аэробов.

17. Третий этап выделения чистой культуры аэробов.

18. Классификация бактерий по источнику энергии.

19. Как делят бактерии по источнику углерода?

20. Как подразделяют бактерии по источнику азота?

21. Какие бактерии называют гетеротрофами?

Основные понятия:

Вид –

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Род –

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Штамм –

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Клон –

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Геновар –

______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Серовар –

______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Биовар –

______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Чистая культура –

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Питательные среды

Категории питательных сред по консистенции:

Питательные среды по составу:

Основные категории питательных сред по назначению:

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Специальные консервирующие транспортные среды

Универсальные накопительные среды

Мясопептонный агар (МПА) и

мясопептонный бульон (МПБ)

Состав среды:

Опишите характер роста колоний микроорганизмов

2.2 Среда Хоттингера

Опишите характер роста колоний микроорганизмов

2.3 Среда Мюллера-Хинтона

Опишите характер роста колоний микроорганизмов

Читайте также:

  
• Суп из морской капусты и рыбными консервами
  
• Суп с маслинами и фрикадельками
  
• Зелень для бульонов фото
  
• Суп с вешенками и гречкой рецепт с фото
  
• Как приготовить борщ в мультиварке скороварке редмонд